熒光強度容易受外界因素的影響,如樣品池、激發(fā)光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質(zhì)、其它溶質(zhì)、表面活性劑等都會造成熒光強度的變化。嚴格控制測試條件對熒光分析來說至關(guān)重要。
①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中,如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
②在熒光分析時,為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù),一般需要開機預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈,預(yù)熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì),盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。
③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度,有利于提高熒光量子產(chǎn)率,熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異,大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大,測試溫度變化不超過±3℃,對測試結(jié)果幾乎無影響。
?、墚敓晒馕镔|(zhì)是弱酸或弱堿時,溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中,分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變,而熒光物質(zhì)的熒光強度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。以苯胺為例:在pH=7~12的溶液中會產(chǎn)生藍色熒光,在pH<2或ph>13的溶液中都不產(chǎn)生熒光。再如,維生素B2(核黃素)在430~440nm藍光照射下會發(fā)出綠色熒光,λem為535nm。它在pH=6~7的溶液中熒光強度大,而在pH=11時熒光消失;但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMn04氧化下都會生成熒光強度比維生素B2強得多的黃光素,并可溶于。利用此性質(zhì)可提高測定的靈敏度和選擇性。
⑤分子結(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中,熒光效率顯著增強。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。